Фрагментный анализ — это метод, при котором к специфичным фрагментам ДНК в ходе ПЦР присоединяется флуоресцентный краситель. Далее продукты реакции разделяются с помощью капиллярного электрофореза, в нашем случае – на генетическом анализаторе Нанофор 05 и определяются по размеру путем сравнения со стандартом длин, наносящимся одновременно. Несмотря на то, что фрагментный анализ заметно дешевле и проще в работе, чем секвенирование по Сэнгеру, для ряда приложений, связанных с анализом тандемных повторов, он превосходит Сэнгера по разрешающей способности. Фрагментный анализ позволяет решать множество задач:
- Генотипирование многих тысяч образцов животных и растений в целях селекции либо паспортизации, как стандартизованными наборами, так и созданными самостоятельно.
- Анализ повторов и SNP в геноме, ассоциированных с определёнными нарушениями \ особенностями
- ДНК-фингерпринтинг, идентификация личности и определение отцовства – но этим занимаются специализированные лаборатории при МВД.
Для фрагментного анализа используются наборы флуоресцентных красителей – меток, связанных с одним из ПЦР-праймеров. Список стандартно используемых красителей для фильтра СК-5 в таблице, для каждого канала должен быть один краситель.
| Каналы детекции сигнала | Длина волны максимума фильтра, нм | Детектируемые флуоресцентные красители |
| 1 | 520 | FAM, R110, AlexaFluoro-488 |
| 2 | 550 | R6G, JOE, VIC, HEX |
| 3 | 580 | TAMRA, NED, Cy3 |
| 4 | 610 | ROX |
| 5 | 650 | LIZ, Cy5, DY632 |
TAMRA с переносом энергии по FAM, ROX с переносом энергии по FAM
Если вы планируете использовать другой красочный набор либо фирменный набор для фрагментного анализа, то вам может потребоваться приобрести и отдать нам калибратор для вашего набора, обычно поставляемый производителем.
Порядок работы:
- Ставите реакцию самостоятельно. Отфасовываете 0,3 – 1 мкл реакции в 96-луночный планшет или стрипованные пробирки. Допустимые варианты планшеты формата ABI (semi-skirted, например SSI 3425-00 или Nest 402601), пробирки формата SSI 3111-00 или аналогичные. Подсушиваете в амплификаторе, заклеиваете плёнкой и передаёте нам (к. 8103 корпус СГК), прикрепив к распечатанному заполненному бланку (линк на Бланк Нанофор Фрагм.анализ.doc). Открываете в Exel бланк (SAMPLE_GS.plate.txt) и копируете во второй стобец названия образцов вместо Sample№. Этот бланк отсылаете нам на почту (CGI@bionet.nsc.ru)
Результаты получаете на указанный адрес. Для просмотра \анализа можно использовать бесплатное ПО от ABI (peak scanner) либо от Синтола.